Fluoreszcens fehérjével jelölt skorpiótoxin, amely pikomoláris affinitással kötődik a Kv1.3 K+ csatornához | Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A Kv1.3 feszültségfüggő káliumcsatorna működésbeli változásait számos autoimmun és neurológiai rendellenességgel hozták összefüggésbe. Az ezt a csatornát kifejező sejtek azonosításának és tanulmányozásának elősegítése érdekében olyan fluoreszkáló molekulát(próbát, szondát) fejlesztettünk ki, amely kötődik a Kv1.3-hoz és mikroszkóp alatt ezáltal láthatóvá válik. A szondát két komponens genetikai összekapcsolásával hoztuk létre: az egyik komponens a Vm24, egy eredetileg skorpiómérgekből izolált kis peptid, amely szelektíven blokkolja a Kv1.3-at, míg a másikaz mCherry, egy vörösen fluoreszkáló fehérje, amelyet fényességének és stabilitásának köszönhetően gyakran használnak biológiai markerként. Az így kapott fúziós fehérjét, az mCherry-Vm24-et, Pichia pastoris expressziós rendszer segítségével élesztősejtekben állítottuk elő, majd tisztítottuk további vizsgálatainkhoz. A biokémiai és funkcionális elemzések megerősítették, hogy a fúziós fehérje helyesen alakult ki és biológiailag aktív. Bár a Kv1.3-hoz való kötődési ereje gyengébb volt, mint az eredeti Vm24 peptidé, az mCherry-Vm24 mégis nagy affinitással kötődött a Kv1.3-hoz (a pikomoláris tartományban). Továbbra is nagyon szelektív maradt a Kv1.3-ra vonatkozóan más hasonló csatornákkal szemben, és szinte visszafordíthatatlan, irreverzibilis kötődést mutatott. Sejtes kísérletekben az mCherry-Vm24 specifikusan jelölte meg azokat a sejteket, amelyek expresszálták az humán Kv1.3 csatornákat, amint azt konfokális mikroszkópos és áramlási citometriás vizsgálatok is igazolták. Egerekben a fúziós fehérje a legerősebb fluoreszcens jelet a vesékben mutatta, és a lépben nagyobb felhalmozódást mutatott, mint az mCherry önmagában. Összességében az mCherry-Vm24 hasznos eszköz a Kv1.3 csatornák kimutatására és vizualizálására, mind a tenyésztett sejtekben, mind az élő szervezetekben, ami támogatja a Kv1.3-expresszió megváltozásával kapcsolatos betegségek további kutatását.

DOI