Hogyan mérhetünk molekuláris kölcsönhatást FRET-tel, ha a minta autofluoreszcenciája magas, vagy egyenlőtlen eloszlású, és/vagy a vizsgált molekulák kifejeződése fiziológiásan alacsony?
A kölcsönhatás bizonyos szignalizációs folyamatok résztvevői között gyakran fontosabb, mint azok expressziós szintjei. A Fröster rezonancia energia transzfer (FRET) egy népszerű eszköz a molekuláris interakciók vizsgálatára. Ennek az alapja a FRET erős távolságfüggése 2-10 nm között. A spektrális átvilágításra korrigált kvantitatív (3 szűrős) FRET módszer egy költséghatékony és sokoldalú mérési eljárás, ami alkalmazható áramlási citometriában és a fluoreszcencia mikroszkópia különböző módozataiban, de pontosságát csökkentheti a minta autofluoreszcenciája. Ebben a közleményben a pixelenkénti autofluoreszcencia korrekció módszertanát és előnyeit mutatjuk be. Az implementációhoz kifejlesztettünk egy sejtmentes kalibrációs tárgylemezt, ami elhanyagolható autofluoreszcenciával rendelkezik, ezzel lehetővé téve a spektrális korrekciós és α kalibrációs faktorok pontos és egyszerű meghatározását. Közzétettünk továbbá egy ImageJ / FIJI beépülő modult, amely alkalmas FRET felvételek interaktív kiértékelésére, valamint több felvételt tartalmazó méréssorozatok automatikus kiértékelésére. A módszer validálásához kalibrációs gyöngy és sejtes alapú FRET modell rendszereket használtunk, amelyek változó arányú autofluoreszcenciával és FRET hatásfokokkal rendelkeztek. Összehasonlítottuk a pixelenkénti autofluoreszcencia korrekcióval, a hagyományos átlagos autofluoreszcenciára történő korrekcióval, valamint az egyszerű háttérkorrekcióval kapott FRET hatásfokokat. A pixelenkénti autofluoreszcencia korrekció pontosabb eredményeket adott, különösen a térben változó autofluoreszcenciájú és az alacsony fluoreszcencia/autofluoreszcencia arányú minták esetében. Emiatt alkalmazása fiziológiás expressziós szintek, valamint kórszövettani diagnosztika esetén kifejezetten ajánlott.
István Rebenku, Cameron B Lloyd, János Szöllősi, György Vereb
Link